O método de reciclagem enzimática , para GSH , glutationa redutase utiliza para quantificar GSH . Este protocolo é especificamente para o plasma , amostras de tecido ou de células em cultura . Adicionar o reagente DTNB ( ácido 5-5' - ditio -bis- 2 - nitrobenzóico ) a GSH . O grupo sulfidrilo na GSH reage com o reagente e produz um ácido amarelo chamado 5 -tio - 2 - nitrobenzóico ( TNB ) . Adicionar glutationa redutase , à mistura de ácido e de GSH para a GSH e reciclar produzir mais ácido . Neste procedimento , a taxa de produção de ácido é proporcional à reacção de reciclagem de GSH ; portanto, medir a absorvância do ácido TNB utilizando um espectrofotómetro . A absorção fornece uma estimativa da quantidade real de GSH na amostra.
Fígado celular glutationa Ensaio
Este protocolo analisa a quantidade de GSH em hepatocarcinoma humano ( câncer de fígado células ) . Para realizar este procedimento , utilize o método colorimétrico para determinação de GSH para reduzir e oxidar GSH . Reduzir GSH usando 5-5' - ditiobis ( ácido 2 - nitrobenzóico ou DTNB ) para formar o
produto de ácido 2 - nitro - 5 - tiobenzóico colorido e glutationa oxidada ( GSSG ) . Use glutationa redutase para reduzir GSSG para formar novamente a GSH . A fim de medir a quantidade de GSH nas células do fígado , leia a amostra a 415 absorção cineticamente num leitor de microplacas .
Celular apoptose
Neste protocolo , a GSH é usado para detectar a apoptose celular ( morte ) através da medição da diminuição da diminuição de GSH . Uma queda na concentração de GSH celular é um indicador da morte celular . Manchar as células da amostra com verde thiolite não fluorescente . O verde thiolite acumula-se no citosol ( plasmática da célula ) e das mitocôndrias ( central eléctrica ) da célula . Use um citômetro de fluxo em 490/520 nanômetros para visualizar a quantidade de GSH nas células.
Concentração total de GSH nas amostras animais e vegetais
Medir a concentração de GSH total tanto da forma reduzida e oxidada em diferentes amostras de plantas e animais . Adicionar o reagente tiol geral , 5-5' - ditiobis [ ácido 2 - nitrobenzóico ] . O reagente tiol reage com GSH , para formar 412 nm cromóforo , ácido 5 - thionitrobenzoic ( TNB ) e GS - TNB . Adicionar glutationa redutase e - Beta nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato ( NADPH ) para reduzir GS- TNB . A glutationa também vai lançar uma segunda molécula de TMB e reciclar o GSH . Além disso , qualquer GSH oxidada ( GSSG ), presente na mistura da reacção fromed dissulfeto também é reduzido para GSH . Use um leitor de microplacas a 405 nanômetros de ler o nível de absorção e indicar a concentração total de GSH .