Como Calibrar Colunas Gel Filtração

colunas de filtração em gel são utilizados para proteínas separadas a partir de misturas complexas. Uma vez que cada proteína tem um peso molecular única , que pode ser induzida a separar em camadas distintas , migrando los através de uma coluna de filtração contendo uma matriz de gel uniformemente distribuída. Para identificar corretamente cada proteína que é separada , você vai precisar para calibrar as colunas utilizando diversas proteínas de weight.Things moleculares conhecidas que você vai precisar
anidrase carbónica
citocromo C
aprotinina
sal Basal
tubos de centrífuga
ferritina
Centrífuga
Pipet bombear
250 ml cilindro graduado
tampão líquido
limpeza Scientific limpa
seringa barril
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1

Retire os frascos de anidrase carbônica , citocromo C e aprotinina da geladeira ou freezer e permitir que atinjam a temperatura ambiente. Adicionar 4 mg de cada proteína para um tubo de centrífuga por mililitro de gel na coluna de filtração . Adicionar 961 mel de sal basal por miligrama de proteína a cada tubo de centrífuga para dissolver as proteínas . Adicionar 39,2 mcl de ferritina por mililitro de gel a cada tubo e , em seguida, misture em uma centrífuga .
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Desligue a bomba coluna de filtração e fechar a torneira na entrada da coluna. Desapertar , mas não eliminam , a parte superior da coluna de filtração . A bomba para o caudal máximo da coluna e reiniciar a bomba até que o material tampão foi retirado . Pare a bomba .
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Adicionar 1 ml de cada proteína para a coluna filtragem utilizando uma bomba pipeta . Pingar para baixo as proteínas no interior da coluna a partir de uma altura de 1 cm a 2 cm, de trabalho em torno da borda interior da coluna . Deixe a mistura de proteína para resolver em cima da matriz de gel.
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Coloque a tubulação de saída da bomba , em um ambiente limpo, seco 250 ml cilindro graduado . Reiniciar a bomba a uma taxa de 0,30 ml por minuto e executar as proteínas no interior da matriz de gel . Enquanto a bomba está a funcionar , lavar os lados do tubo, utilizando a pipeta de bomba e uma pequena quantidade de líquido tampão . Uma vez que as proteínas tenham entrado completamente a matriz de gel , reduzir a velocidade da bomba de 0,02 ml por minuto e a bomba em uma camada de 5 cm a 7 cm de líquido tampão na parte superior da matriz .
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Desligue o cap coluna da torneira . Limpar a tampa e o interior da coluna de coluna usando toalhetes de limpeza científicos . Recoloque a tampa do coluna. Encha o reservatório de passagem de líquido buffer. Anexar uma seringa para a torneira e abri-lo. Usar a seringa para extrair uma pequena quantidade de tampão através do tubo e para dentro da seringa . Fechar a torneira e anexá-la ao topo da coluna. Abra a torneira e verifique se há vazamentos .
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Executar a coluna em 0,02 ml por minuto por vários dias , até que a banda ferritina se aproxima do fim da coluna. Colete todo o gel filtração que é bombeado para fora do cilindro graduado .