Esfriar a temperatura da amostra de células de 41 a 50 graus Fahrenheit. Isto permite uma melhor taxa de absorção do material fluorescente pelas células .
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Carregar a amostra de células com uma substância indutora de fluorescência , tais como BCECF . Isto é feito por adição do BCECF ao meio celular , em seguida, agitar a mistura suavemente durante 2,5 horas. O BCECF é absorvido através da membrana permeável das células .
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Separaram-se as células do meio e todo o BCECF não absorvida pela execução da amostra através de uma centrífuga . Colocar as células em um recipiente separado .
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Aquece-se a amostra de células de 98,6 graus centígrados , durante 30 minutos , para aproximar as condições no interior do corpo humano . Se as células sujeitas a exame vivem normalmente em algum outro meio ambiente do que o corpo humano , ajustar a amostra até à temperatura adequada .
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excitar a amostra celular por agitação . Isto ajuda a aumentar a actividade fluorescente .
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Medir intensidade de fluorescência da amostra de células usando o espectrofotómetro . Para melhores resultados, usar a luz em comprimentos de onda de excitação de 500-510 nanômetros. Nestes comprimentos de onda , há uma maior proliferação de intensidade de fluorescência , de modo que é mais fácil para diferenciar os resultados . A intensidade de fluorescência é medida em unidades relativas ( RFU ) fluorescentes , a razão entre a luminosidade da substância num estado animado , fluorescente ao seu estado normal , não excitado . Quanto maior for a RFU , mais brilhante a substância , em comparação ao seu estado normal.
7
Comparar os resultados de espectrofotometria de curvas de calibração pré - desenhadas . De um modo geral , superior fluorescente significa um pH mais elevado dentro da amostra . Com um comprimento de onda de excitação de 510 nm , uma substância com um pH de 6,4 , deveria mostrar um RFU de cerca de 20 , enquanto que uma substância com um pH de 9,9 , deveria mostrar um de cerca de 55 RFU